因具备快速、准确、简便地实现基因组敲除、插入、替换等编辑能力，CRISPR /Cas9 系统在过去十几年中逐渐成为应用最为广泛的基因编辑技术；另一方面，将催化失活的 Cas 变异体（dCas）与转录激活 / 抑制效应因子融合，成为基因特异性激活（CRISPRa）/ 抑制（CRISPRi ）的新方案，也为通过转录激活 / 抑制进行大规模高通量的功能基因筛选带来新选择。目前，基于 sgRNA 慢病毒文库的 CRISPRa/CRISPRi 功能基因筛选，已经应用于植物、哺乳动物永久细胞系中功能增益 / 缺失基因的筛选。但由于原代细胞体外培养时间有限、病毒载体转导效率低等因素的限制，CRISPRa/CRISPRi 筛选技术在原代细胞中的大规模应用尚存在一定挑战。近日，Science 上一篇标题为 “CRISPR activation and interference screens decode stimulation responses in primary human T cells” 的论文中报告了使用 CRISPRa 和 CRISPRi 筛选在人类原代 T 细胞中发现发挥作用的基因的研究：美国格拉德斯通研究所和加州大学旧金山分校的研究人员团队开发了可在人类原代 T 细胞中使用 CRISPRa 和 CRISPRi 进行大规模基因功能筛选的平台，并将其应用于 T 细胞响应刺激的细胞因子产生的功能调节基因的全基因组筛选。该论文通讯作者 Alexander Marson 所带领的实验室专注于揭示人类免疫细胞的遗传和表观遗传调控机制，以开发并应用基因编辑技术治疗癌症、传染病、自身免疫性疾病等。（来源：Science）结合单细胞测序技术，该研究团队对 70 个全基因组筛选命中和控制引起的人体原代 T 细胞单细胞状态进行了深度分子表征，揭示了激活 / 抑制因子对 T 细胞调控的影响方式。论文中提到，此次报告的研究为首次实现 CRISPRa 在人类原代免疫细胞中的大规模使用，该论文通讯作者、格拉德斯通 – 加州大学旧金山分校基因组免疫学研究所主任 Alexander Marson 博士表示，“这项研究取得了令人兴奋的突破，为我们了解人体免疫细胞中的功能基因提供了可靠线索，增加了从遗传方面调控免疫细胞的认知，将加速癌症、自身免疫性疾病免疫疗法的研究”。优化慢病毒载体，实现高效递送在癌症、自身免疫性疾病中，杀伤性 T 细胞发挥着至关重要的作用。随着技术的深入研究和发展，通过基因工程手段改造患者 T 细胞以治疗疾病的 CAR-T 疗法，在治疗血液系统恶性肿瘤中显现出了极大的优势，但目前多数处于临床研究阶段，对于 T 细胞功能基因的研究仍有很长的路要走。通过功能基因筛选出影响基因组表达的目标基因，是用基因工程手段治疗疾病的基础。2018 年，同样是 Alexander Marson 领导的团队，通过其开发的 SLICE 技术将 CRISPR/Cas9 系统递送至人体原代 T 细胞中，并进行了全基因筛选。他们发现，敲除 UBASH3A、CBLB、CD5 和 RASA2 这 4 个靶标基因可以显著提高 T 细胞的增殖和对抗疾病的能力，相关论文发表在 Cell 上。（来源：Cell）然而，近日发表的论文共同第一作者、Marson 实验室博士后研究员 Zachary Steinhart 表示，“敲除基因对了解免疫细胞的基本功能是很有效的，但仅通过基因敲除的方法可能会错过一些基因的其他关键信息，比如当一个基因更加活跃时会发生什么情况我们并不清楚。”这也是 Marson 实验室此次使用 CRISPRa 和 CRISPRi 进行人体 T 细胞功能基因筛选的主要原因。与基于 CRISPR/Cas9 系统，通过以切割目标 DNA 序列为前提的基因编辑工作不同，CRISPRa 和 CRISPRi 通过激活或沉默某个基因位点的方式，对基因组表达进行调控。基于表观调控的功能基因筛选方案，被认为是基因敲除法筛选功能基因的良好补充。于是，Marson 团队从另一个方向出发，再次踏上了探索人体 T 细胞功能的路。为克服将 CRISPRa 或 CRISPRi 复合物高效递送到人体原代 T 细胞中这一难题，Marson 团队开发了一种优化的高滴度慢病毒载体生产方案，使用最小的 dCas9-VP64 载体 ，基因转导效率可以达到 80%。Marson 表示，“提高将 CRISPRa 或 CRISPRi 复合物递送到细胞中的效率，对实现全基因组筛选以及加速靶标的发现至关重要。”实现 CRISPRa 或 CRISPRi 复合物高效递送至人体原代 T 细胞中后，Marson 团队依据其高滴度慢病毒载体平台，使用 CRISPRa/CRISPRi 对从四名志愿者身上分离出的原代 T 细胞中 18800 个进行了全基因组 CRISPRa 筛选。其中，以 CD4+T 细胞生长因子白介素 – 2 (IL-2) 以及 CD8+T 细胞中抵抗病毒、细菌感染等的干扰素 -γ (IFN-γ) 的产生水平为指标， Marson 团队的 sgRNA 定量结果显示，靶向 IL-2 和 IFN-γ 的 sgRNA 在各自的细胞因子群体中高度富集，分别显示 444 和 471 个靶向命中，而非靶向控制 sgRNA 在各个群体中均未富集。图 |人体原代 T 细胞全基因组 CRISPRa 筛选（来源：Science）进一步地，他们通过 CRISPRa/CRISPRi 方法发现了调节功能性细胞因子的关键因子，其中包括过表达状态下可促进 IFN-γ 产生的 4-1BB、CD27、CD40 和 OX40 受体，可增强 T 细胞活性的近端 TCR 复合物成员 VAV1、CD28、LCP2 和 LAT。“我们的研究证明了 CRISPRa/CRISPRi 技术在人类原代 T 细胞中靶向的精确性和可扩展性。”大规模应用面临很大挑战在 CRISPR 技术出现之前，RNAi 一直是功能基因筛选的首选方案，但其存在的脱靶效应高、调节效果不明显等弊端，使风险更低的基于 CRISPR 技术的功能基因筛选成为人们新的选择。对于人类疾病的治疗而言，在更接近于人体环境内的原代细胞中进行功能基因筛选将为遗传疾病的发生机制研究、治疗方案开发提供更为可靠的依据。对于 CRISPRa 技术在原代细胞中的大规模部署，有业内相关人士表示，大规模高转染效率病毒载体的生产，低脱靶率 sgRNA 的设计合成，以及免疫风暴的控制等方面都存在一定的挑战。虽上述提到的方案通过优化的慢病毒载体在 CRISPRa 的方法下实现了人类原代 T 细胞的全基因筛选，但向 CRISPRa 技术应用于临床治疗人类疾病只是迈近了一小步。“并且目前来看，显然该领域研究远远不足，大多数疾病的致病靶点还是未知数，基因靶点与致病表现型的直接对应关系尚未建立，而特异性靶点的选择是推动疾病治疗的首要条件。”Marson 团队也提到，接下来将使用这一技术继续发现更多控制人类免疫细胞中关键功能的基因，为下一代细胞免疫治疗提供方案。在基因异常导致的疾病中，无论通过敲除基因还是激活 / 抑制基因的方法发现治疗疾病的靶点，还是开展下一步的药物研发，可以说功能基因的筛选都是一个大的前提。因此，找到稳定的、高效的激活 / 抑制某一基因的方法是科研人员所期待的。